乌菲兹美术馆的考古收藏是世界最古老的收藏，来源于美第奇家族对古代文物的兴趣。从15世纪开始，美第奇家族收藏古代文物以振兴人文主义研究，这促使佛罗伦萨、罗马和威尼托的艺术家和文化人士将热情聚焦在古代文物上。
美第奇家族奠基人老柯西莫（Cosimo the Elder,1389-1464）在收藏古代雕像前曾咨询过博学的学者波焦•布拉乔利尼（Poggio Bracciolini,1380-1459）和西里亚科•德•安科纳（Ciriaco D’Ancona,1391-1452）的意见，遗憾的是这些雕像已遗失。
在皮耶罗•德•美第奇（Piero de Medici,1416-1469）从佛罗伦萨被驱逐后，洛伦佐•德•美第奇（Lorenzo de Medici, 1449-1492）收藏的最好的古代雕像曾放置于圣马可修道院的花园内，现已遗失。在其他的珍贵收藏中，华丽的法尔内塞杯（Farness Cup）目前被那不勒斯考古学博物馆（Naples Archaeological Museum）所收藏，它曾被桑德罗•波提切利（Sandro Botticelli,1445-1510）等画家研究过。
1537年被暗杀的亚历山德罗•德•美第奇（Alessandro de’Medici,1510-1537）的收藏也散落到别处，但是柯西莫一世（Cosimo I de' Medici，1519-1574）在收藏古代文物上做出了重要贡献，其作为古代伊特鲁里亚国王的化身，收购了伊特鲁里亚的铜质品，现存放在考古学博物馆内，而购置的罗马皇帝的半身雕像展现出政治地位的重要性。
柯西莫一世的儿子弗朗切斯科一世（Francesco I de’Medici，1541-1587）也购置了一批雕像。而红衣主教费迪南多（Cardinal Ferdinando,1549-1609）的收藏后来转移到乌菲兹美术馆，如《维纳斯》（Venus）、《磨刀人》（Knife-grinder）和《摔跤手》（Wrestlers）。
下图为《维纳斯》，公元前1世纪的古罗马复制品
摔跤手，公元前1世纪的古罗马复制品
磨刀人，公元1世纪的古罗马复制品
乌菲兹美术馆的名望首先来自绘画。16世纪后期，其雕像存放于东翼顶层第一走廊（First Corridor）内，包括米开朗基罗的酒神巴克斯（Bacchus）的现代雕像，19世纪，它们被转移到巴杰罗博物馆（Bargello）。17世纪和18世纪，乌菲兹美术馆古代雕像来自美第奇家族别墅，在1748年修复顶层的过程中，其雕像和半身像的位置做出了调整并被忠实地记录下来。
素描和印刷
素描和印刷文本橱柜收藏了超过100多万份的素描和印刷文本，它是世界最重要的收藏之一，包含从14世纪开始的众多学派，不限于意大利学派。其中最大的托斯卡纳地区素描组别，包含达芬奇、米开朗基罗、安德烈亚•德尔•萨尔托（Andrea Del Sarto,1486-1530）和蒙托莫（Pontormo,1494-1557）等画家的近一万份素描。
下图为佛罗伦萨画家安东尼奥•波莱奥洛（Antonio Pollaiolo，1429-1498）于1475绘制的素描《裸体人的战斗》
在乌菲兹美术馆中，美第奇家族的素描收藏是整个素描收藏的核心，时间最早可追溯到洛伦佐•德•美第奇的身上。艺术史学家和鉴赏家乔尔乔•瓦萨里（Giorgio Vasari，1511-1574）指出，由洛伦佐•德•美第奇所拥有的素描存放在圣马可修道院的雕像花园内，这些素描由著名艺术家创作，展示的是美丽，用作研究和娱乐。
从14世纪末开始，佛罗伦萨学派已意识到素描的重要性，艺术理论家琴尼诺•琴尼尼（Cennino Cennini，1360-1427）对艺术家提出了建议：将素描作为艺术创作的基础。柯西莫一拥有米开朗基罗和皮耶罗•迪•柯西莫（Piero di Cosimo,1462-1522）的素描，而他的儿子弗朗切斯科一世收藏着达芬奇的素描。
到17世纪，素描收藏已系统化。在日益增长的非凡的艺术收藏中，利奥波多红衣主教（Leopoldo de' Medici,1617-1675）在碧提宫的素描收藏达到1.2万幅，这些素描被博学家菲利波•巴尔迪努奇（Filippo Baldinucci，1624-1696）编辑成目录供研究之用。
下图为荷兰画家伦布朗（Rembrandt,1606-1669）于1649年绘制的素描《耶稣治疗病人》
1687年，依然处于增长的收藏被转移到乌菲兹美术馆。到18世纪，许多素描被悬挂在绘画作品的旁边。下图为弗朗切斯科•马佐拉（Francesco Mazzola, 1503-1540）于1530年绘制的《圣母、圣子和圣人》。
19世纪，数以千计用于研究的素描于1849年被首次加以展示。从1867年开始，他们被放置于瓦萨里走廊（Vasari Corridor）直到1909年。随后这些收藏被转移到现在的位置，在此之前，它们被二层的美第奇剧场所占据。
艺术家创作的肖像画和自画像
肖像画的原创可追溯到古代。在乌菲兹美术馆的走廊内，美第奇家族收藏的古希腊、古罗马半身像受到人们的赞扬。古代大师在肖像画上展示出他们的才能，具体表现在形象的逼真效果。文艺复兴时期的理论家曾指出同时代艺术家具有和古代大师竞争的能力，比如乔托（Giotto,1267-1337）。
在意大利，个别肖像画早在14世纪就已出现。但只作为赞助人的形象，例如，乔提诺（Giottino,1324-1369）于1360年到1365年绘制的《哀悼耶稣》（Pietà）中展示出两名妇女的肖像画，见下图。
1436年，作家、画家和建筑家的莱昂纳多•巴蒂斯塔•阿尔伯蒂（Leon Battista Alberti,1404-1472）曾追溯肖像画的神秘原创性，赞扬画家塑造人物的逼真效果。据考证，阿尔伯蒂是意大利最早绘制自画像的画家，他说许多知名人物已出现在历史绘画中。
画家马萨乔（Masaccio,1401-1428）1422年在佛罗伦萨圣母圣衣教堂（Santa Maria del Carmine）绘制的湿壁画中就塑造过自身形象。按照艺术史学家乔尔乔•瓦萨里的描述，不计其数的头戴头巾和身披斗篷的公民形象出现在佛罗伦萨，包括布鲁莱内斯基（Brunelleschi,1377-1446）、多纳太罗（Donatello,1386-1466）和马索利诺（Masolino da Panicale,1383-1447）。
在西方艺术中，最早的著名肖像画出现在1432年，是由佛兰德斯画家扬•范•艾克（Jan Van Eyck，1390-1441）绘制的。意大利最早的肖像画出现在1437年，是一对夫妻结婚时的肖像画，现保存于纽约大都市博物馆，是由赞美佛兰德斯绘画艺术的意大利画家弗拉•菲利波•利皮（Fra Filippo Lippi，1406-1469）绘制的，后来他在1439年到1447年创作祭坛画《圣母加冕》（Coronation of the Virgin）中将自己的自画像加入，他身穿修道士的装束，好奇地看着观众（见下图）。画家波提切利也曾将自己的自画像放置在1475年绘制的《贵人的崇拜》中。
在15世纪的镶嵌板绘画中，一个稀有的三人肖像画制作于1440年，描述三位艺术家塔迪奥（Taddeo）、加多（Gaddo）和阿格诺罗•加迪（Agnolo Gaddi），一人面向前方，其他两人为侧面的轮廓照，见下图。
此外，由保罗•乌切诺（Paolo Uccello，1397-1475）绘制的五人肖像画，现保存于卢浮宫，其中包括乔托（Giotto，1267-1337）、多纳太罗、保罗•乌切诺、布鲁莱内斯基以及他的传记作家安东尼奥•曼内蒂（Antonio Manetti，1423-1497）。这幅肖像画是人文主义者的颂歌。
在16世纪，拥有较高社会地位的画家创作的自画像展示出独有的特征。下图为意大利画家和建筑家安德烈亚•波佐（Andrea Pozzo）在罗马圣依纳爵罗耀拉教堂（Sant'Ignazio, Rome）打造著名的虚幻圆顶时绘制的自画像（1680年到1688年）。
乔尔乔•瓦萨里对艺术家的面相非常感兴趣。他在1568年出版的《意大利艺术家传记》的第二版中，为每位艺术家附上肖像画，这样可更好地描述其个性特征。1664年富有远见的利奥波多•德•美第奇通过欧洲各地的银行家购置自画像，目前乌菲兹美术馆的自画像收藏是世界最重要的收藏。归功于捐献者和他们的后代。
宫廷系列的肖像画
在数千幅肖像画中，最特殊的收藏为宫廷系列，共计484幅，悬挂在乌菲兹美术馆通道内，这类叙述男人的肖像画由柯西莫一世牵头组织。1552年，他委托克里斯托费诺(Cristofeno dell’Altissimo，1525-1605)复制人文主义者保罗•乔维奥（Paolo Giovio,1483-1552）的著名文学家肖像画系列收藏。画家的创作持续到1589年，复制的肖像画先是放置在旧宫，后来转移到碧提宫。
1587年，弗朗切斯科一世在乌菲兹美术馆第一走廊内展示这些作品。现行的布置遵照1597年制定的目录顺序。下图为著名人文主义者马特奥•帕尔梅里（Matteo Palmieri,1406-1475）的肖像画，由画家克里斯托法诺(Cristofano dell'Altissimo，1525-1605)完成于1552年。
17世纪和18世纪的肖像画（Aulic Series）悬挂在第二通道和第三通道上，是对美第奇家族成员的赞美，从弗朗切斯科一世开始。下图为法国国王亨利四世的妻子玛丽•德•美第奇（Marie de' Medici,1575-1642）的肖像画，由佛兰德斯画家小弗兰斯•普布斯（Frans Pourbus the Younger,1569-1622）绘制于1613年，见下图。
微型绘画和小型肖像画
大约有1200幅微型绘画和小肖像画可以追溯到17世纪，其中包括红衣主教利奥波多的收藏，他也收藏素描和自画像。下图为法国画家弗朗索瓦•克鲁埃的车间于1570年制作的《法国国王亨利二世和妻子以及家族其他成员的微型肖像画》。
美第奇家族的其他成员还拥有羊皮纸古文稿和其他的小型肖像画，下图为意大利女画家拉维尼亚•丰塔纳（Lavinia Fontana，1552-1614）于1579年绘制的小型自画像。
从1664年到1675年，红衣主教利奥波多生活的最后11年，他从家族成员那里获得了来自佛兰德斯和英国的肖像画。1672年，他购置了古代画家创作的肖像画。他去世留下的500多幅小肖像画于1737年转移到乌菲兹美术馆。
